As constantes incursões do conquistador espanhol Dom Nuño Beltrán de Guzmán pelas terras ocidentais do país, a fim de aumentar seu domínio e poder sobre esses territórios, resultaram no estabelecimento de uma nova província que se chamou Novo Reino da Galiza.
A região era habitada por vários grupos indígenas, que continuamente devastavam os assentamentos que os espanhóis haviam fundado ali. O tenente de Nuño de Guzmán, capitão Juan B. de Oñate, recebeu ordens para pacificar aquelas províncias e fundar a Villa de Guadalajara no lugar denominado Nochistlán, fato que se consuma em 5 de janeiro de 1532. Diante dos freqüentes ataques indígenas à cidade ele teve que se mudar um ano depois para Tonalá e depois para Tlacotlán. Uma terceira transferência foi feita para instalar a cidade no Vale de Atemajac, onde a cidade foi fundada definitivamente no dia 14 de fevereiro de 1542 com a presença de Cristóbal de Oñate como governador da Nova Galícia e Dom Antonio de Mendoza, depois vice-rei da Nova Espanha, que nomeou Miguel de Ibarra prefeito e vice-governador.
A cidade desenvolveu-se rapidamente e passou a competir com a de Compostela (hoje Tepic), então sede de poderes religiosos e civis, de forma que os habitantes de Guadalajara exerceram tanta pressão sobre as autoridades da Audiencia, que o rei Felipe II decidiu expedir certidão datada de 10 de maio de 1560 para que pudesse se deslocar de Compostela a Guadalajara, a Catedral, a Corte Real e os oficiais da Fazenda.
A estrutura urbana foi planejada de acordo com a das demais cidades coloniais, por isso seu layout foi desenvolvido em forma de tabuleiro de xadrez a partir do que era a praça de San Fernando. Posteriormente, os bairros de Mexicaltzingo e Analco foram fundados por Fray Antonio de Segovia, e o bairro de Mezquitán, um dos mais antigos. Também foram construídas as casas da Câmara Municipal, em frente ao atual templo de San Agustín e à primeira igreja paroquial onde está localizado o Palácio da Justiça.
Hoje, a magnífica cidade, prolífica em edifícios coloniais, exibe um bom número de exemplos arquitetônicos relevantes, como sua Catedral, um local imperdível, construída entre 1561 e 1618 pelo arquiteto Martín Casillas. Seu estilo foi classificado como barroco incipiente. A sua sólida estrutura ergue-se em frente à hoje Plaza de Guadalajara, com as suas curiosas torres que, embora não façam parte do estilo original do edifício, são hoje reconhecidas como um símbolo da capital guadalajara. As torres primitivas foram destruídas no século 19 por um terremoto, razão pela qual as que possui hoje foram adicionadas. O interior do templo é de estilo semi-gótico, incluindo suas abóbadas feitas de renda.
Outros recintos religiosos do século XVI são o convento de São Francisco, estabelecido em 1542 junto ao rio, no bairro Analco, e quase totalmente destruído na Reforma. Seu templo, reformado no final do século XVII, com sua fachada barroca de modestas linhas salomônicas, está preservado. O convento de San Agustín, foi fundado em 1573 por Portaria Real de Felipe II e atualmente preserva seu templo com sua fachada de severo traço Herreriano e seu interior com abóbadas nervuradas.
Santa María de Gracia, outra das fundações conventuais, foi ocupada por freiras dominicanas de Puebla, construída em 1590 em frente à Plaza de San Agustín e custeada por Hernán Gómez de la Peña. A construção chegou a ocupar seis quarteirões, embora hoje permaneça apenas o seu templo, com fachada neoclássica da segunda metade do século XVIII.
